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Controle remoto eletromagnético sem fio da expressão de transgenes em mamíferos
13/05/2025
Resumo
A comunicação entre receptores de campo sem fio e sensores biológicos continua sendo uma restrição fundamental no desenvolvimento de dispositivos eletrônicos sem fio para monitoramento médico minimamente invasivo e aplicações biomédicas envolvendo terapias gênicas e celulares. Aqui, descrevemos uma interface nanopartícula-célula que permite a programação eletromagnética da regulação da expressão sem fio (EMPOWER) de transgenes por meio da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) celulares em um nível de biossegurança. Nanopartículas multiferroicas revestidas com quitosana para melhorar a biocompatibilidade geram ROS no citoplasma das células em resposta a um campo magnético de baixa frequência (1 kHz). Biossensores KEAP1/NRF2 superexpressos e responsivos a ROS detectam as ROS geradas, que são reconectadas a promotores sintéticos responsivos a ROS para impulsionar a expressão do transgene. Em um estudo de prova de conceito, células microencapsuladas em alginato implantadas subcutaneamente, expressando de forma estável um sistema de expressão de insulina controlado por EMPOWER, normalizaram os níveis de glicose sanguínea em um modelo murino de diabetes tipo 1 em resposta a um campo magnético fraco.
Principal
A biologia sintética revolucionou a engenharia celular para aliviar inúmeras doenças 1 , 2 , incluindo dor crônica 3 , obesidade 4 , diabetes 5 , câncer 6 e atrofia muscular 7 , e para investigar circuitos neurais 8 e interfaces bioeletrônicas 9 , 10 . Em particular, estímulos físicos de circuitos genéticos, como luz 11 , som 12 , sinais elétricos 13 , 14 e campos magnéticos 15 , 16 , foram intensamente explorados para controle espaço-temporal de saídas terapêuticas. Para contornar o desafio da propagação de sinal sem fio, campos eletromagnéticos (EMFs) de força, frequência, duração e localização variadas foram explorados em conjunto com as propriedades mecânicas 17 , 18 , 19 ou térmicas 8 , 20 , 21 de nanopartículas magnéticas para permitir o acoplamento com canais iônicos em membranas celulares. CEMs com amplitude < 50 mT e frequência < 1 MHz minimizam a dissipação de energia em tecidos vivos 22 e, portanto, são adequados para interruptores programáveis remotamente para estimular funções celulares com influência mínima em sistemas nativos. No entanto, a tecnologia legada pioneira na programação eletromagnética do comportamento celular foi baseada na coordenação in vivo específica de células de nanopartículas inorgânicas para canais ou receptores de células nativas ou projetadas usando anticorpos 23 , 24 ou marcadores 16 , 18 , 25 , que podem provocar efeitos fora do alvo de nanopartículas conjugadas 26 , 27 , promover toxicidade hepática 20 , 28 ou limitar a robustez devido ao tráfego intracelular de canais e receptores 29 , resultando em sintonização limitada 22 e biossegurança 30. Portanto, projetamos e testamos uma interface genética versátil e robusta que permite o controle remoto ajustável da expressão transgênica terapêutica por células projetadas microencapsuladas usando CEM de baixa potência.
Materiais multiferroicos que harmonizam efeitos magnetostritivos e piezoelétricos podem explorar campos magnéticos para gerar eletricidade para aplicações biológicas, como detecção remota de atividade cerebral, estimulação neural profunda 31 , reparo de defeitos ósseos 32 e degradação de agregados β-amiloides de Alzheimer 33 . Esses efeitos ocorrem quando solventes aquosos e solutos transferem portadores de carga de superfícies de materiais multiferroicos para produzir eletrófilos, principalmente espécies reativas de oxigênio (ROS) 34 , 35 . Assim, CEMs de CA militesla na faixa de baixa frequência (0,1–1 kHz) são promissores como um portal biológico via ROS.
ROS atuam como sinais citoplasmáticos nativos em sistemas vivos, e as células humanas contêm componentes que podem detectá-los e responder a eles 36 , 37 . Quando exposta a ROS elevados, a proteína 1 associada a ECH semelhante a Kelch (KEAP1), que contém resíduos de cisteína sensíveis a ROS, libera o fator nuclear eritroide 2 fator relacionado a p45 2 (NRF2), permitindo que o NRF2 se transloque e se ligue a elementos de resposta antioxidante intranucleares (AREs), resultando em respostas antioxidantes transcricionais 38 . Aqui, utilizamos nanopartículas multiferróicas (CoFe 2 O 4 @BiFeO 3 @chitosan, CBCFO) geradoras de ROS magnetoresponsivas para se comunicar com células sensibilizadas a ROS pela superexpressão de KEAP1/NRF2 e reconectamos o NRF2 a promotores sintéticos contendo ARE, construindo assim um sistema que chamamos de programação eletromagnética de regulação de expressão sem fio (EMPOWER). Neste sistema, as nanopartículas de CBCFO incorporadas servem como nanorreceptores de um campo eletromagnético externo, fornecendo sintonização eletromagnética da geração de ROS para direcionar a expressão transgênica da proteína alvo pelas células hospedeiras. Para prova de conceito e como exemplo, escolhemos validar o sistema EMPOWER para o gerenciamento da glicose sanguínea em diabetes tipo 1 experimental (DT1) porque o diabetes é uma condição médica dinamicamente altamente desafiadora com prevalência dramaticamente crescente 39 , 40 , 41 . Portanto, implantamos células humanas transgênicas com o sistema EMPOWER encerradas em microcápsulas de alginato coerentes e clinicamente licenciadas em camundongos DT1 e os expusemos a um EMF para controlar a liberação de insulina. A estimulação EMF de baixa frequência (1 kHz) de 21 mT por 3 min por dia induziu efetivamente a secreção de insulina das células projetadas controladas por EMPOWER implantadas subcutaneamente e restaurou a normoglicemia em camundongos DT1 durante todo o período experimental de 4 semanas.
Resultados
Caracterização de nanopartículas de quitosana-multiferróicas
Para detectar o campo magnético para controle da expressão transgênica mediada por ROS, sintetizamos nanopartículas multiferróicas de núcleo-casca de CoFe2O4 @BiFeO3 (BCFO) consistindo de núcleos de nanopartículas magnetostritivas de CoFe2O4 ( CFO ) e cascas piezoelétricas de BiFeO3 ( BFO ), com a camada externa de quitosana para formar as nanopartículas de CBCFO, conforme ilustrado na Fig. 1a . Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) e mapeamento de espectroscopia de raios X de energia dispersiva (EDX) correspondente (Fig. 1b ) confirmaram a estrutura das nanopartículas de CBCFO, conforme demonstrado pelas distribuições de cobalto, bismuto e nitrogênio no CFO, BFO e quitosana. O perfil de linha da nanopartícula de CBCFO mostra as distribuições espaciais representativas de cobalto, bismuto e nitrogênio, confirmando quantitativamente a estrutura. O espectro EDX indicou conteúdos atômicos semelhantes de cobalto e bismuto nas nanopartículas de CBCFO (Fig. Suplementar 1 ), em contraste com as nanopartículas de CFO (Fig. Suplementar 2a ) e BCFO (Fig. Suplementar 2b ). As nanopartículas de CBCFO tinham 35,5 ± 10,3 nm de diâmetro, enquanto os diâmetros das nanopartículas de CFO e BCFO eram 25,4 ± 6,1 nm e 32,9 ± 8,5 nm, respectivamente, de acordo com os resultados da microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ( n = 50 partículas). No pH fisiológico de 7,4, o diâmetro hidrodinâmico das nanopartículas de CBCFO é 36,3 ± 4,8 nm e seu índice de polidispersão atinge 0,190 (Fig. Suplementar 3 ). Os padrões de difração de raios X (XRD) revelaram a estrutura de espinélio cúbico do CFO com um grupo espacial Fd 3 m e a estrutura de perovskita romboédrica do BFO com um grupo espacial R 3 c (Fig. 1c ) 33 , 42 .
Fig. 1: Construção e caracterização de nanopartículas de CBCFO.
a , Ilustração da síntese de nanopartículas de CBCFO. b , Imagens de campo claro (BF) STEM e resultados de EDX correspondentes com mapeamento elementar colocalizado de cobalto, bismuto e nitrogênio são consistentes com uma estrutura núcleo-casca de nanopartículas de CBCFO. Barra de escala, 50 nm. c , Padrão XRD exibindo a cristalinidade de BCFO. Preto, BCFO; B, picos de BiFeO 3 ; C, picos de CoFe 2 O 4 . d , Espectros de infravermelho de reflectância total atenuados de BCFO, quitosana e CBCFO. e , Potencial zeta de BCFO e CBCFO, antes e depois do revestimento com a camada de quitosana. f , A viabilidade celular após a exposição a nanopartículas de CBCFO depende da massa de nanopartículas por milhão de células. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3 ( e ) ou n = 4 ( f ) experimentos independentes. Os valores de p em f foram calculados em relação ao controle não induzido correspondente por um teste t não pareado bilateral .
Na análise de infravermelho de reflectância total atenuada, a região entre 800 e 1.200 cm −1 mostra absorção característica da estrutura do sacarídeo de quitosana (Fig. 1d ) 43 . Os processos de protonação e hidratação da quitosana durante o revestimento de nanopartículas de CBCFO são refletidos em mudanças na banda assimétrica –NH entre 1.300 e 1.700 cm −1 em comparação com o pó de quitosana. Os grupos amônio resultantes dentro da camada de quitosana das nanopartículas de CBCFO contribuem para a carga superficial positiva de 31,6 ± 4,6 mV em comparação com a carga negativa (−22,5 ± 5,5 mV) das nanopartículas de BCFO (Fig. 1e e Fig. Suplementar 4 ). Células contendo até 50 μg de BCFO ou 100 μg de CBCFO por 106 células renais embrionárias humanas (HEK-293) mantiveram mais de 95% de viabilidade após 48 h (Fig. 1f ). Esses resultados orientaram nossa escolha da faixa de concentração para a seguinte avaliação in vitro. A diminuição da viabilidade celular em concentrações mais altas de CBCFO foi diretamente correlacionada com o acúmulo citosólico e presumivelmente resultou de alterações excessivas no potencial da membrana mitocondrial, que desencadearam a liberação de citocromo C associada à apoptose (Dados Estendidos, Fig. 1 ).
Produção de ROS induzida eletromagneticamente in vitro
Sob estimulação de campo eletromagnético CA (EMFS), o BCFO multiferróico gera polarização elétrica devido à tensão de rede interfacial entre o BFO e o CFO 44 , 45 . A separação de carga do BCFO fornece portadores de carga excitados na superfície das nanopartículas de CBCFO, levando à produção local de ROS, como radical superóxido (O 2 −· ) e radical hidroxila (OH · ) em um ambiente aquoso 33 (Fig. 2a ). As nanopartículas de CBCFO exibem loops de histerese magnética (faixa EMF, −30 a 30 kOe) sob condições ambientais (Fig. 2b ), com uma magnetização de saturação ( M s ) e magnetização remanescente ( M r ) de 77,8 e 45,2 emu g −1 , respectivamente, significando ferromagnetismo em temperatura ambiente. O ferromagnetismo reduzido do CBCFO derivado de nanopartículas de BCFO ( M s = 96,8 emu g −1 , M r = 57,2 emu g −1 ) é atribuível ao conteúdo de quitosana. Para os experimentos a seguir, empregamos CEMs de frequência de 1 kHz e intensidade de campo de até 21 mT para evitar qualquer efeito térmico adverso 22 em sistemas vivos e para manter o acoplamento efetivo da interface BFO–CFO 44 . Um dispositivo baseado em bobina de Helmholtz foi montado para gerar um CEM ac uniforme de 9–21 mT em placas multipoços (Fig. Suplementar 5 ). O potencial elétrico induzido do pó de CBCFO em uma configuração de tensão de circuito aberto (OCV) (Fig. 6a suplementar ) foi medido com uma EMF de 1 kHz e 21 mT e atingiu 0,11 V (Fig. 2c ), em contraste com o controle de polarização do dispositivo de 0,016 V (Fig. 6b suplementar ). A separação de carga relativa foi detectada por um ensaio de ácido tereftálico (TA) dependendo da força da EMFS (Dados Estendidos Fig. 2a,b ). A capacidade dos portadores de carga de induzir ROS foi avaliada medindo a descoloração não específica mediada por ROS do azul de metileno (ensaio MB, Dados Estendidos Fig. 2c,d ). A taxa de degradação de 39% com nanopartículas de CBCFO (5 mg ml −1 ) após 1 h de EMFS (1 kHz, 21 mT) indica uma produção significativa de ROS de CBCFO com EMFS, em comparação com grupos de controle de CBCFO puro e EMFS sozinho.
Fig. 2: Produção de ROS estimulada eletromagneticamente e expressão transgênica em células transfectadas transitoriamente.
a , Ilustração esquemática do efeito magnetoelétrico das nanopartículas de CBCFO e produção de ROS. b , Curvas de histerese magnética de CFO, BCFO e CBCFO à temperatura ambiente com intensidades de campo magnético variando de -30 kOe a +30 kOe. c , O comportamento ligado/desligado do OCV induzido pelas nanopartículas de CBCFO depende do campo magnético CA aplicado (21 mT, 1 kHz). d , Quantificação baseada em fluorescência dos níveis de ROS celular após estimulação EMF (21 mT, 1 kHz, 3 min). e , Esquema do mecanismo proposto de expressão gênica induzida eletromagneticamente em células responsivas projetadas transfectadas com pJH1003, pJH1004 e pJH1005. As ROS geradas pelo CBCFO estimulado por EMF interrompem a interação entre KEAP1 e NRF2, inibindo assim a ubiquitinação pelo complexo de ligase de ubiquitina (Ub) associado a KEAP1. Consequentemente, o NRF2 é translocado para o núcleo, onde se liga a pequenas proteínas Maf (sMaf) e aos elementos de resposta antioxidante (ARE) nas regiões reguladoras de seus genes-alvo. f , Produção de SEAP por células responsivas a ROS transfectadas transitoriamente contendo nanopartículas de CFO, BCFO e CBCFO. g , A expressão de SEAP depende da razão CBCFO-célula (campo magnético, 21 mT; 3 min). h , Expressão gênica dependente de campo eletromagnético (tempo de estimulação, 3 min). A expressão de SEAP foi máxima em 21 mT, atingindo níveis de pico que se comparam aos níveis de SEAP de células isogênicas nas quais SEAP é conduzido por um forte promotor constitutivo (149,3 ± 8,7 U l −1 ). i , Expressão gênica dependente do tempo de estimulação (campo magnético, 21 mT). Os dados são apresentados como média ± DP, n = 6 ( d , g ), n = 4 ( f ) ou n = 3 ( h , i ) experimentos independentes. Os valores de p em d – i foram calculados versus o controle não estimulado correspondente. A significância estatística foi analisada por ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett ( d ), ANOVA bidirecional com teste de comparações múltiplas de Bonferroni ( f ) e ANOVA bidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett ( g , h , i ). Esquemas de mecanismo criados com BioRender.com.
A quantificação in vitro mostrou que a produção intracelular de ROS foi acelerada com CBCFO em contraste com os grupos controle imediatamente após 3 min de EMFS (1 kHz, 21 mT) (Fig. 2d ). A aceleração ocorreu principalmente nos primeiros 30 min (Dados Estendidos Fig. 3a ) e declinou nas 3–6 h seguintes (Dados Estendidos Fig. 3b ). Não confirmamos nenhuma diferença significativa na viabilidade celular entre os grupos estimulados e não estimulados devido a essa produção acelerada de ROS (Dados Estendidos Fig. 3c ), e a viabilidade celular começou a diminuir apenas com EMFS de 5 min ou mais (Dados Estendidos Fig. 3d ).
Expressão gênica transitória controlada eletromagneticamente
Para utilizar EMF para expressão genética, cotransfetamos células HEK-293 com plasmídeos de expressão constitutivos KEAP1 (pJH1004, P hCMV -KEAP1-pA ) e NRF2 (pJH1003, P hCMV -NRF2-pA ) para construir um sistema de biossensores de ROS, juntamente com o repórter pJH1005 ( P DART -SEAP-pA ; P DART , O ARE -P hCMVmin ) que codifica a glicoproteína humana modelo SEAP (fosfatase alcalina secretada pela placenta humana) para quantificação do nível de expressão (Tabela Suplementar 1 ). Nessas células, a produção celular de ROS induzida eletromagneticamente via nanopartículas de CBCFO interfere na interação NRF2–KEAP1, levando à liberação e translocação de NRF2 para o núcleo, o que resulta na expressão da proteína de interesse (POI) do promotor P DART contendo ARE específico de NRF2 (Fig. 2e ). Em comparação com células projetadas incorporadas em CFO, a expressão de SEAP estimulada eletromagneticamente foi significativamente elevada (13,8 vezes) em comparação com o controle não estimulado (Fig. 2f ). O grupo CBCFO apresentou menor vazamento e um nível de expressão mais alto do que o grupo BCFO, de acordo com a maior captação celular e melhor capacidade de escape do endossomo, conforme avaliado por imagens de microscopia de lapso de tempo (Dados Estendidos Fig. 4a,b ), colocalização de fluorescência (Dados Estendidos Fig. 4c–e ) e citometria de fluxo (Dados Estendidos Fig. 4f,g ). Esses resultados podem ser atribuídos ao efeito esponja de prótons da modificação da quitosana 46 . A captação celular de nanopartículas de CBCFO ocorre por meio de endocitose mediada por clatrina clássica (Dados Estendidos Fig. 5a ) e nenhuma extrusão de nanopartículas celulares ocorreu além de 3 dias após a captação celular (Dados Estendidos Fig. 5b ). Não foi observado vazamento nas preparações dos implantes em 4 semanas, confirmando a integridade das microcápsulas à base de alginato (Dados Estendidos Fig. 5c ). O nível de expressão do transgene aumentou com o aumento da concentração de CBCFO, atingindo o pico em uma concentração de CBCFO de 50 μg por 10 6 células sob um EMF de 21 mT e 1 kHz por 3 min (Fig. 2g ), correspondendo a 1,5 × 10 4 J s m −3 em densidade de energia média por volume. Na concentração de CBCFO de 50 μg por 10 6 células, o nível de SEAP aumentou junto com a força do EMF (0–21 mT; Fig. 2h). O nível de expressão do SEAP pode ser ajustado com precisão variando o tempo de EMFS a 21 mT (Fig. 2i ). O EMPOWER é caracterizado em células HEK-293, conhecidas por sua conveniência em engenharia e seu uso na fabricação de biofármacos 7 , 41 , 47 , mas também funciona em uma variedade de células de mamíferos (Dados Estendidos Fig. 6 ).
Liberação estimulada de insulina em células HEK EMPOWER encapsuladas
Para construir o sistema EMPOWER para produção e liberação de insulina controlada por EMF em células humanas, primeiro estabelecemos linhas celulares HEK-293 estáveis projetadas para expressão constitutiva de KEAP1 ( ITR-P hCMV -KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR , pJH1054), NRF2 ( ITR-P hCMV -NRF2-pA:P RPBSA -ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR , pJH1101) e expressão de insulina dependente de NRF2 ( ITR-P DART4 -NLuc-P2A-mINS-pA:P mPGK -ZeoR-pA-ITR , pJH1196; P DART4 , O ARE4 -P hCMVmin ). A nanoluciferase (NLuc) foi usada como um repórter bioluminescente para triagem. A melhor linhagem celular monoclonal da categoria, HEK EMPOWER , exibiu expressão ectópica de KEAP1 e NRF2 e apresentou a maior indução de dobramento de NLuc (Dados Estendidos, Fig. 7 ). Para personalizar as células HEK EMPOWER para implantação, elas foram misturadas com nanopartículas de CBCFO e encapsuladas em microcápsulas de alginato clinicamente licenciadas 48 para proteger as células modificadas do sistema imunológico do hospedeiro, permitindo a difusão de nutrientes e a liberação de biofármacos. O desempenho dos implantes contendo HEK EMPOWER foi validado sob um EMF uniforme baseado em bobina de Helmholtz. A intensidade do campo magnético (Fig. 3a ) e a dependência do tempo de estimulação (Fig. 3b ) da produção de insulina foram avaliadas. O nível mais alto de insulina de 2,76 ± 0,45 μg l −1 foi obtido sob um EMFS de 21 mT e 3 min, o que é consistente com os resultados para a expressão de NLuc (Dados Estendidos, Fig. 8 ). Um estudo cinético revelou que a produção de insulina estimulada pelas células HEK EMPOWER atingiu um nível significativo no sobrenadante da cultura em 3 h e foi mantida por mais de 24 h (Fig. 3c ). Também confirmamos a excelente reversibilidade nos padrões de estimulação liga/desliga em intervalos de 24 h ao longo de 5 dias (Fig. 3d e Dados Estendidos, Fig. 8d ). Sob condições de estimulação padrão (1 kHz, 21 mT, 3 min), a expressão do transgene foi comparada favoravelmente com os níveis relatados de expressão gênica desencadeada por ROS 49 , e a exposição diária a EMF (21 mT, 1 kHz, 3 min por dia) não teve impacto na viabilidade celular durante o período experimental de 4 semanas (Fig. 3e ), sugerindo que o sistema EMPOWER estava operando com desempenho quase ideal (Figs. 2 e 3 ).
Fig. 3: Expressão gênica estimulada eletromagneticamente em células HEK EMPOWER microencapsuladas.
a , Expressão de insulina dependente de campo magnético (tempo de estimulação, 3 min). b , Expressão de insulina dependente do tempo de estimulação (campo magnético, 21 mT, 1 kHz). c , Produção de insulina dependente do tempo durante 36 h após uma estimulação EMFS de 21 mT, 1 kHz, 3 min. A criação de perfil foi iniciada imediatamente após a estimulação EMF. d , Reversibilidade da produção de insulina. As células foram estimuladas alternativamente com um EMFS de 21 mT por 3 min (ligado) ou não estimulado (desligado) em intervalos de 24 h. O meio de cultura celular foi renovado cada vez que a estimulação EMF foi alternada de ligado para desligado ou de desligado para ligado. e , Viabilidade de HEK EMPOWER após estimulação EMF diária de 3 min por 4 semanas (21 mT, 1 kHz, 3 min por dia), em comparação com células HEK EMPOWER não estimuladas . Todos os dados são apresentados como média ± dp; n = 6 ( a , b ) e n = 3 ( c , d ) experimentos independentes. Os valores de p em a – c foram calculados em relação ao controle não estimulado correspondente. Os fatores de indução foram calculados entre os grupos não estimulados (EMFS (−)) e estimulados (EMFS (+)). A significância estatística foi analisada por ANOVA bidirecional com teste de Tukey ( a , b ) e ANOVA unidirecional com teste de comparações múltiplas de Dunnett ( c , d ).
Homeostase da glicose alimentada eletromagneticamente em DT1
Para validação in vivo, projetamos um gerador de EMF de bobina única com um núcleo de ferro em forma de E (Fig. 4a ). O EMF deste dispositivo de bobina única atingiu 20–22 mT em um plano de 3–5 mm da superfície da bobina, o que corresponde à profundidade da implantação subcutânea em camundongos. Este dispositivo gera um gradiente de campo magnético em vez do campo uniforme do dispositivo de bobina de Helmholtz. O dispositivo foi capaz de estimular a expressão do transgene das células encapsuladas in vitro, e nenhuma diferença significativa foi observada em comparação com o dispositivo de bobina de Helmholtz (Fig. Suplementar 7 ). Para EMFS de bobina única in vivo, cinco dispositivos foram encaixados em um suporte impresso em 3D para facilitar a estimulação paralela de camundongos (Fig. 4b e Fig. Suplementar 8 ).
Fig. 4: Avaliação in vivo de células HEK EMPOWER para tratamento controlado sem fio de DT1.
a , Esquema ilustrando a estimulação do campo magnético de células HEK EMPOWER encapsuladas implantadas no lado dorsoventral de camundongos, usando um dispositivo de bobina única do tamanho de um centímetro. b , Esquema mostrando a estimulação simultânea de um grupo experimental de camundongos com uma montagem paralela de dispositivos de bobina única. c , Ajustabilidade da secreção de insulina dependente do tempo de estimulação (21 mT, 1 kHz, 0–3 min). d , e , Reversibilidade dos níveis de insulina ( d ) e glicose sanguínea ( e ) controlados por EMF . Os implantes HEK EMPOWER subcutâneos microencapsulados foram expostos à estimulação EMF alternada de ligado para desligado e desligado para ligado a cada 3 dias (ligado: 21 mT, 1 kHz, 3 min; desligado: não estimulado). f , g , Os níveis de insulina sanguínea em jejum ( f ) e glicose sanguínea ( g ) foram registrados antes da implantação (semana 0) e por até 4 semanas consecutivas após a implantação de células HEK EMPOWER em camundongos T1D estimulados por 3 min (21 mT, 1 kHz): grupo EMFS (+). Os grupos de camundongos T1D e WT com implantes de células HEK EMPOWER não estimulados (EMFS (−)) e sem implantes (não tratados) foram usados como controles. Durante todo o período de tratamento de 4 semanas, os camundongos WT alimentados mantiveram níveis médios de insulina sanguínea de 2,1 ± 0,8 µg l −1 . h , O GTT intraperitoneal foi realizado em camundongos 3 dias após a implantação de células microencapsuladas e após jejum por 8 h. Os dados são apresentados como média ± sd, n = 5 ( c – g ) e n = 10 ( h ) réplicas biológicas. Os valores de p em d , e foram calculados entre os dados indicados e o controle inicial (dia 0) de DM1 não estimulado. Os valores de p em g , h foram calculados em relação ao controle não estimulado correspondente (preto, abaixo) e ao controle WT (verde, acima). A significância estatística em d – h foi analisada com ANOVA bidirecional e testes de comparação múltipla de Dunnett. Ilustrações esquemáticas de camundongos criadas com BioRender.com.
As células HEK EMPOWER encapsuladas implantadas em camundongos T1D foram submetidas a uma estimulação de campo magnético de 3 minutos (grupo EMFS (+) T1D) usando os dispositivos de bobina única. A cinética de secreção de insulina correspondeu àquelas encontradas para outras modalidades de controle de transcrição e os níveis de insulina foram consistentes com aqueles em estudos anteriores usando T1D experimental como um modelo de prova de conceito (Dados Estendidos Fig. 9 ) 7 , 12 , 41 , 47 , 50 , 51. Os níveis de secreção de insulina de HEK EMPOWER puderam ser ajustados variando o tempo de estimulação EMF (Fig. 4c ) e o controle glicêmico foi totalmente reversível; alternar o EMFS de desligado para ligado ou de ligado para desligado a cada 3 dias resultou em alterações correspondentes nos níveis de insulina (Fig. 4d ) e de glicose no sangue (Fig. 4e ). A secreção de insulina induzida por EMFS (Fig. 4f ) das células HEK EMPOWER atenuou os níveis de glicose no sangue e subsequentemente manteve a normoglicemia nos camundongos T1D (Fig. 4g ). Além disso, a produção de insulina desencadeada por EMFS pelas células HEK EMPOWER melhorou as excursões glicêmicas pós-prandiais em testes de tolerância à glicose (GTTs) e restaurou os níveis normoglicêmicos (Fig. 4h ). As medições glicêmicas em tempo real confirmaram que a estimulação diária das células HEK EMPOWER por 3 minutos poderia restaurar os níveis normoglicêmicos em camundongos T1D e manter a homeostase da glicose por pelo menos 4 semanas sem qualquer excursão hipoglicêmica. Nenhuma diferença significativa nos níveis de glicose no sangue ou insulina foi observada em camundongos selvagens (WT) não estimulados implantados com células HEK EMPOWER (grupo EMFS (-) WT) em comparação com camundongos WT não tratados. Isto confirma a ausência de vazamento do sistema EMPOWER e é consistente com a ausência de episódios hipoglicêmicos. No final do período de tratamento, os animais não apresentaram sinais de inflamação macroscópica (Dados Estendidos Fig. 10a ) ou sistêmica (Dados Estendidos Fig. 10b–d ), e análises histológicas do local de implantação indicaram que as cápsulas EMPOWER permaneceram no lugar, intactas e não afetadas pela estimulação EMF (Dados Estendidos Fig. 10e,f ). O ganho de peso corporal (1,5 ± 0,6 g por camundongo), a ingestão diária de alimentos (6,5 ± 0,8 g por camundongo) e o consumo de água (7,7 ± 1,6 ml por camundongo) de camundongos T1D estimulados por EMF foram idênticos aos de camundongos WT na fase terminal do período de tratamento de 4 semanas.
Conclusões
Os CEMs representam modalidades de controle promissoras e minimamente invasivas para terapias de próxima geração baseadas em genes e células. As metodologias de estimulação magnética de primeira classe relatadas até agora usam principalmente canais de membrana ou receptores conjugados a nanopartículas inorgânicas ativadas por acoplamento térmico ou mecânico 8 , 15 , 31 . No entanto, ainda permanecem desafios associados à funcionalização de receptores e canais e ao tráfego intracelular, bem como efeitos e toxicidades fora do alvo, robustez limitada, capacidade de ajuste e tradução clínica desses métodos 22 , 27 , 29 , 30 . Em vez disso, nosso trabalho utiliza nanopartículas multiferróicas modificadas para se comunicar com sensores ROS citoplasmáticos KEAP1/NRF2, proporcionando uma interface nanopartícula-célula para conduzir a expressão transgênica por meio de promotores sintéticos para terapia celular eletromagnética sem fio. Para testar essa abordagem, nos concentramos no DM1, uma das doenças crônicas dinamicamente mais desafiadoras, que requer controle meticuloso da glicemia e administração diária de insulina. Em um modelo murino de DM1, EMFS diário (21 mT, 1 kHz, 3 min.) de células HEK EMPOWER microencapsuladas e implantadas subcutaneamente foi suficiente para conduzir a expressão transgênica de insulina a um nível suficiente para produzir normoglicemia sustentada. Nosso estudo de prova de conceito restaurou com sucesso a normoglicemia em um modelo murino de DM1 experimental ao longo do período experimental de 4 semanas, demonstrando controle in vivo dinamicamente robusto, reversível e ajustável. O sistema EMPOWER comparou favoravelmente em desempenho com modalidades terapêuticas baseadas em células estabelecidas usando estímulos químicos 7 , 41 , 49 , 52 e físicos 12 , 13 com tecnologia de encapsulamento celular idêntica, que foi validada para longevidade 53 e em ensaios clínicos em humanos 48 .
As nanopartículas de CBCFO usadas aqui exibem acoplamento eficiente entre compósitos magnetostritivos e piezoelétricos 45 , enquanto o polímero quitosana, de origem biológica e carga positiva, melhora a biocompatibilidade e a adesão celular 54 . Além de proteger os óxidos férricos nus do ambiente celular, a quitosana também permite que as ROS de curta duração geradas pelas nanopartículas de CBCFO escapem dos endossomos para o citoplasma por meio do efeito esponja de prótons 46 . De fato, tais nanopartículas multiferróicas foram injetadas diretamente no cérebro ou na circulação sanguínea para estimulação neuronal profunda 26 , administração nervosa central guiada 55 e dissociação de agregados β-amiloides do Alzheimer 33 . Uma vantagem fundamental do nosso sistema é que a estimulação celular pode ser desencadeada com uma dose muito menor de nanopartículas (50 μg por 10 6 células, mais de 20 vezes menor do que nas aplicações mencionadas anteriormente) 56 . Os implantes microencapsulados com alginato também minimizam o risco de danos ao fígado 53 associados à administração direta de nanopartículas 27 . Além disso, os níveis de ROS celulares aumentaram imediatamente após a estimulação e então declinaram dentro de 3–6 h, e o sistema KEAP1/NRF2 reconhece esse pico de ROS, não um acúmulo gradual de ROS 14 , como tipicamente observado em sistemas de sinalização de ROS 57 . Tal cinética limita o efeito adverso de ROS em células HEK EMPOWER , como evidenciado pela reversibilidade da estimulação da expressão de proteína terapêutica.
Um EMF de baixa frequência de 1 kHz impõe um efeito magnetotérmico ou força mecânica insignificante sobre as células 22 . Mais importante ainda, porque mesmo indutores químicos de ROS produzindo surtos sistêmicos de ROS não têm impacto aparente na fisiologia ou metabolismo celular 14 , a indução de ROS desencadeada por EMF confinada à vizinhança de nanopartículas de CBCFO intracelulares deve ter pouco risco de potenciais efeitos colaterais. Além disso, nosso trabalho destaca o uso de EMFs fracos (até 21 mT), muito mais fracos do que aqueles usados em scanners de ressonância magnética (na faixa de Tesla), prometendo segurança no uso clínico. Este nível de EMFS pode ser alcançado por uma única bobina de indução com uma estrutura de bobina fixa e parâmetros de entrada (semelhantes a carregadores de telefone sem fio), e sintonizado ajustando um único parâmetro, o tempo de estimulação, evitando a necessidade de software complexo ou implantes eletrônicos. Acreditamos que esse tipo de interface entre dispositivos eletrônicos programáveis e terapias genéticas tem o potencial de agilizar drasticamente o regime de tratamento para pacientes com doenças crônicas.
Métodos
Fabricação de CBCFO
As nanopartículas de CFO foram sintetizadas de acordo com a literatura com modificações 33 . Para preparar as nanopartículas de CFO, hexaidrato de cloreto de ferro(III) (0,995 g) e cloreto de cobalto(II) (0,239 g) foram misturados em água deionizada (35 ml) contendo brometo de hexadeciltrimetilamônio (2,041 g). Solução de hidróxido de sódio (6 M) foi então adicionada gota a gota à mistura sob agitação contínua para atingir um pH final de 11,0. Após estimulação por ultrassom por 30 min, tratamento hidrotérmico adicional foi aplicado à mistura a 180 °C por 24 h em uma autoclave de aço inoxidável revestida de Teflon de 50 ml. Os precipitados pretos resultantes foram lavados com água deionizada e etanol várias vezes após resfriamento à temperatura ambiente.
Para sintetizar nanopartículas magnetoelétricas de BCFO, um tratamento sol-gel foi aplicado às nanopartículas de CFO preparadas 33 . Resumidamente, nanopartículas de CFO (50 mg) foram dispersas em 30 ml de etilenoglicol (número de catálogo 324588, Sigma-Aldrich) contendo nitrato de bismuto(III) pentahidratado (0,160 g) e nitrato de ferro(III) nonaidratado (0,121 g). Após 2 h de sonicação, a mistura de sol foi movida para uma estufa a vácuo e seca por 24 h. Em seguida, a mistura em estado de gel resultante foi pré-aquecida a 400 °C por 30 min para eliminar compostos orgânicos e sucessivamente calcinada a 500 °C por 90 min. As nanopartículas de BCFO resultantes foram lavadas várias vezes com água deionizada e etanol em uma membrana de náilon e coletadas com um ímã permanente de neodímio após tratamento por ultrassom.
A quitosana (código de catálogo 448877-50 G, Sigma-Aldrich) foi primeiramente dissolvida em NaCl 0,1 M para formar uma solução a 0,1% após acidificação com ácido acético a 1%. A quitosana marcada com isotiocianato de rodamina B (RITC) foi preparada dissolvendo-se RITC (40 µM, código de catálogo CAY20653-100 mg, Cayman) em metanol e misturando-o 1:1 com uma solução de quitosana a 10 mg/ml sob proteção de nitrogênio, seguida de diálise contra NaCl 0,1 M. As nanopartículas de BCFO preparadas foram então dispersas e misturadas na solução de quitosana (5 mg/ml ) por sonicação por 1 h. As nanopartículas de CBCFO foram coletadas por centrifugação e lavadas com água três vezes. As nanopartículas RITC-CBCFO foram fabricadas pela mistura de nanopartículas de BCFO com quitosana marcada com RITC.
Para captação celular, todas as nanopartículas foram sonicadas a 35 kHz por 30 min (Bandelin Electronic, RK100H) e filtradas através de um filtro de 0,22 µm (número de catálogo P668.1, Carl Roth).
Caracterização do CBCFO
A morfologia das nanopartículas de CFO, BCFO e CBCFO obtidas foi examinada por TEM (FEI F30) e STEM (JEM-F200). A distribuição dos elementos ao longo das nanopartículas foi estudada por mapeamento STEM EDX (JEM-F200). A estrutura cristalográfica das nanoestruturas foi analisada por XRD em um difratômetro de raios X Bruker AXS D8 Advance 1, equipado com um alvo de cobre em um comprimento de onda de 1,542 Å. As propriedades magnéticas foram avaliadas por microscopia de sonda de varredura (Bruker Dimension ICON) de acordo com o modelo de força magnética. O potencial zeta e o tamanho hidrodinâmico das amostras foram medidos por um Zetasizer de espalhamento de luz dinâmico (Malvern, ZEN3600) em DPBS (0,01 M, pH 7,4). A separação relativa de carga e a indução de ROS a partir de nanopartículas foram avaliadas por ensaio de TA (3 mM, λ ex / λ em = 310/430 nm) e ensaio de MB (5 mM, λ abs = 664 nm), respectivamente, utilizando um leitor de placas (Tecan, Spark Reader). Para os ensaios de TA e MB, uma solução aquosa (400 μl) contendo diferentes nanopartículas foi exposta a um campo magnético sob agitação constante, e alíquotas de 100 μl do sobrenadante foram transferidas para placas de 96 poços para medição colorimétrica ou fluorométrica.
Estimulação de campo magnético
Suportes impressos em 3D contendo eletroímãs (Figs. Suplementares 5a e 8c ) foram projetados para minimizar o efeito térmico em sistemas biológicos. As amostras foram expostas a um EMF uniforme colocando-as na área central (5,8 cm × 5,8 cm) de um dispositivo baseado em bobina de Helmholtz. Os circuitos (Fig. Suplementar 5c ) para estimulação de campo magnético foram alimentados por drivers elétricos projetados sob medida. A intensidade do campo gerado pelo dispositivo de bobina de Helmholtz foi de 9–21 mT e a gerada pelo dispositivo de bobina única foi de 20–22 mT em um plano de 0,3–0,5 cm da bobina, com a frequência fixada em 1 kHz (sinusoidal). A amplitude do campo magnético alternado aplicado foi confirmada por um gaussímetro.
Cultura e engenharia de células
Cultura de células
Células renais embrionárias humanas (HEK-293, ATCC, CRL-11268), células-tronco mesenquimais imortalizadas por telomerase humana (hMSC-TERT, RRID: CVCL_Z015), linhagem celular de câncer de fígado humano (HepG2, ATCC, CRL-11997), células de ovário de hamster chinês (CHO-K1, ATCC, CCL-61), células renais de hamster bebê (BHK-21, ATCC, CCL-10) e células tumorais da hipófise de camundongo (AtT-20, ATCC, CCL-89) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, número de catálogo 52100-39, Thermo Fisher Scientific) suplementado com 100 mM de prolina (somente CHO-K1), 10% de soro bovino fetal (FBS, número de catálogo F7524, Sigma-Aldrich) e 1% (v/v) estreptomicina/penicilina (número de catálogo L0022, Biowest) a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO 2 .
Transfecção celular
Para a transfecção, 104 células (CellDrop BF Brightfield Cell Counter, DeNovix) foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços (código de catálogo 3599, Corning Life Sciences) 24 h antes da transfecção, adicionando-se 20 µl de uma mistura contendo 0,3 µg de polietilenoimina (PEI MAX, peso molecular 40.000, 1 µg µl -1 em H2O bidestilada , código de catálogo 24765-2, Polysciences) e 0,1 µg de DNA plasmidial (concentrações equimolares para misturas plasmidiais) por poço. Após 8 h, a mistura foi substituída por um meio de cultivo padrão ou suspensão de meio de nanopartículas (100 µl) para posterior caracterização.
Construção de linha celular monoclonal
Células HEK-293 (1,5 x 10 5 ) foram cotransfectadas com pJH1101 ( ITR-P hCMV -NRF2-pA: P RPBSA -ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR ) (200 ng), pJH1054 ( ITR-P hCMV -KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR ) (550 ng), pJH1096 ( ITR-P ARE -NLuc-P2A-mINS:P mPGK -ZeoR-pA-ITR ) (400 ng) e pJH42 ( P hCMV -SB100X-pA ) codificando a expressão constitutiva de uma transposase hiperativa da Bela Adormecida (SB) (200 ng) 58 . Após a seleção para duas passagens em meio de cultura suplementado com 2,5 μg ml −1 de puromicina, 300 μg ml −1 de blasticidina e 300 μg ml −1 de zeocina, a população policlonal resistente foi dividida por meio de triagem de células únicas mediada por FACS baseada em ECFP em 48 linhagens celulares monoclonais. Doze linhagens celulares monoclonais com a maior intensidade de fluorescência baseada em ECFP foram carregadas com nanopartículas de CBCFO (50 μg por 10 6 células) e estimuladas por EMF (1 kHz, 21 mT, 3 min). HEK EMPOWER (clone número 3), apresentando a melhor indução de dobramento transgênico estimulada por EMF da categoria, foi escolhido para estudos posteriores (Figura 7a de Dados Estendidos ).
Microencapsulação e implantação de células HEK EMPOWER
Para proteger as células HEK EMPOWER do sistema imunológico do camundongo, permitindo a troca de nutrientes e a liberação de proteínas terapêuticas, usamos uma tecnologia de encapsulamento baseada em alginato validada em ensaio clínico 48 . As células HEK EMPOWER foram encapsuladas em microcápsulas de alginato/poli( L -lisina)/alginato com um diâmetro de 400 µm tratando uma mistura de 9,0 × 10 7 células com 18 ml de alginato (p/v, 1,6%; Na-alginato, número de catálogo 71238, Sigma-Aldrich) em um encapsulador (Inotech Encapsulator IE-50R, EncapBiosystems) equipado com um bico de 200 µm. Uma seringa de 20 ml foi operada a uma taxa de fluxo de 20 ml min -1 com uma frequência de vibração de 1,2 kHz e voltagem de 1,2 kV para dispersão de esferas. Uma solução de 100 ml de poli( L -lisina) 2000 (p/v, 0,05%; código de catálogo 25988-63-0, Alamanda Polymers) e uma solução de 100 ml de alginato a 0,03% foram usadas sequencialmente para formar as microcápsulas. Para a administração, 2,5 × 106 células encapsuladas em 0,5 ml de DMEM isento de soro foram implantadas subcutaneamente através de uma seringa de 3 ml (código de catálogo 9400038, Becton Dickinson) com uma agulha de 0,7 mm × 30 mm (código de catálogo 30382903009009, Becton Dickinson).
Experimentos com animais
Preparação de modelos experimentais de camundongos
Camundongos C57BL/6JRJ foram mantidos e monitorados em grupos ( n = 5) em ambiente controlado a 21 ± 2 °C e 55 ± 10% de umidade, mantidos em ciclo inverso de 12 horas de claro-escuro, com livre acesso à dieta padrão e água. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as normas suíças de bem-estar animal, aprovadas pelo Serviço Veterinário do Cantão de Basileia-Cidade, Suíça (número de licença 2996_34477), pela República Francesa (número do projeto DR2018-40v5 e número APAFIS 16753) e pela República Popular da China (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Westlake, protocolo ID20-009-XMQ). Os experimentos foram conduzidos por PGR (número de licença LTK 5507), G. Charpin-El Hamri (número 69266309; Universidade de Lyon, Institut Universitaire de Technologie) ou por S. Xue (Universidade Westlake). Dois grupos de camundongos foram utilizados: camundongos WT e camundongos T1D induzidos experimentalmente. Para induzir a condição T1D, camundongos WT machos (8–9 semanas de idade, 18–23 g) foram injetados intraperitonealmente com estreptozotocina (STZ; 75 mg kg −1 , tampão citrato 0,2 M, pH 4,2; Sigma-Aldrich, número de catálogo S0130) por 4 dias consecutivos após um período de jejum de 6 h 59 . Camundongos WT controle da Janvier Labs (18–23 g) receberam injeções idênticas sem STZ. Dez dias após a injeção final de STZ, os níveis de glicose no sangue em jejum foram medidos usando tiras de teste ContourNext e um leitor ContourNext ONE (Ascensia Diabetes Care; números de catálogo 84191451 e 85659367) para confirmar a hiperglicemia persistente e o estado de DM1 no grupo tratado com STZ.
Procedimento experimental
Células HEK EMPOWER microencapsuladas com nanopartículas de CBCFO (50 μg por 10 6 células) foram implantadas subcutaneamente nos grupos experimental e controle. Os pelos do lado dorsoventral dos camundongos foram completamente raspados, e os animais foram anestesiados com 4% de isoflurano e mantidos sob 2% de isoflurano durante a cirurgia. Células HEK EMPOWER microencapsuladas foram injetadas subcutaneamente (0,5 ml de DMEM, 5 × 10 6 células) no lado dorsoventral usando uma seringa de 5 ml com uma agulha de calibre 21 para reduzir o risco de afrouxamento asséptico. Após um período de estabilização de 24 horas, as células HEK EMPOWER foram estimuladas sem fio usando um dispositivo portátil (baseado em bobina única) (Fig. 4b ) por 3 minutos uma vez a cada 24 horas no grupo EMFS (+). Durante o resto de cada dia, os animais tratados não foram contidos. Os dispositivos de bobina única ( n = 5) foram encaixados em um suporte impresso em 3D (Fig. 8d suplementar ) e um túnel retangular (com cinco furos paralelos, Fig. 8b suplementar ) foi usado para maximizar a eficiência e facilitar experimentos paralelos. Os animais ficaram em jejum por 6 h antes de medir os níveis de glicose e insulina no sangue. Para o experimento GTT, os animais tratados foram injetados intraperitonealmente com 1,5 g kg −1 de glicose e a glicemia foi registrada em intervalos regulares ao longo de 2 h. O monitoramento da glicose no sangue em tempo real foi realizado em pontos de tempo regulares ao longo de um período de 4 semanas após um período de jejum de 6 h. Juntamente com os níveis glicêmicos, os níveis correspondentes de insulina no sangue também foram medidos e comparados com aqueles dos grupos WT e T1D não tratados.
Coleta de sangue
O nível de glicose no sangue foi monitorado periodicamente usando tiras de teste ContourNext e um leitor ContourNext ONE (números de catálogo 84191451 e 85659367, Ascensia Diabetes Care) 60 . Os níveis de insulina no sangue foram avaliados em amostras de soro coletadas em tubos separadores de soro Microtainer (centrifugados a 6.000 g por 10 minutos a 4 °C; número de catálogo 365967, Becton Dickinson) com um ensaio ELISA ultrassensível (número de catálogo 10-1247-01, Mercordia).
Histologia
HEK EMPOWER microencapsulado e tecido circundante foram explantados de camundongos estimulados e não estimulados por EMF e fixados durante a noite em formalina tamponada a 10% (100 ml de formalina a 40%, 900 ml de H2O bidestilada , 4 g l −1 de NaH2PO4 , 6,5 g l −1 de Na2HPO4 , pH 7). As amostras de tecido foram aparadas, desidratadas em concentrações crescentes de etanol, clarificadas com xileno, incluídas em cera de parafina, processadas em fatias de 5 µm usando um sistema EXAKT 300 CP (EXAKT Technologies) e coradas com hematoxilina e eosina. As secções de tecido foram analisadas por microscopia de luz (Olympus CKX53) e as imagens foram adquiridas com uma câmera Olympus DP75.
Estatística e reprodutibilidade
A apresentação dos dados, o tamanho da amostra de réplicas biológicas ( n ), a análise estatística e a significância das diferenças são mostrados nas legendas das figuras. Todos os experimentos in vitro foram repetidos pelo menos duas vezes, a menos que indicado de outra forma. Para os experimentos com camundongos, réplicas biológicas ( n = 5 camundongos por grupo) foram aleatoriamente designadas para diferentes grupos experimentais. Os detalhes são descritos na legenda de cada figura. Para determinar a significância estatística das diferenças no caso de comparações múltiplas, usamos o GraphPad Prism 10 (v.10.1.0, GraphPad Software) e um teste t de Student bicaudal, não pareado e análise de variância (ANOVA) unidirecional ou bidirecional. Nenhum método estatístico foi usado para pré-especificar os tamanhos das amostras, mas nossos tamanhos de amostra são os mesmos relatados anteriormente 12 , 14. A distribuição dos dados foi assumida como normal, mas não foi testada formalmente. Todos os pesquisadores envolvidos neste estudo foram cegos para a alocação do grupo durante a coleta e análise de dados. Nenhum animal ou ponto de dados foi excluído das análises por qualquer motivo.